Hükümdarlığı sırasında İspanya'nın birliğini sağlamış ve Kristof Kolomb'un Yenidünya'yı keşfiyle güçlü bir sömürge imparatorluğunun temelleri atılmıştır.
 
Kastilya kralı II. Juan ile Portekizli Isabel'in kızı, sonradan babasının yerine tahta çıkan IV. Enrique'nin ise üyev kardeşiydi. On üç yaşındayken kralın gözetimi altında yetişmesi için saraya getirildi. Kardeşi Alfonso'nun çevresinde toplanmış olan Enrique'nin muhalifleri, onun Temmuz 1468'de ölümü üzerine Isabel'e yöneldiler. Ama Isabel muhalefetin sözcüsü olmayı kabul etmedi ve Toros de Guisando Antlaşması'yla (19 Eylül 1468) IV. Enrique tarafından tahtın varisi ilan edildi.

Tahtın varisi olması nedeniyle, Isabel'in yapacağı evlilik İspanya'da ve dış ülkelerde yoğun tartışmalara yol açtı. Portekiz, Fransa ve Aragon değişik önerilerde bulundular. Enrique, Isabel'in Portekiz kralı V. Alfonso, Fransızlar ise Guienne dükü ile evlenmesini istiyordu. Ama Isabel, danışmanlarının da etkisiyle Aragon tahtının varisi Fernando ile evlenmeye karar verdi ve Enrique'nin onayı olmadan Ekim 1469'da Valladolid'deki Juan de Vivero Sarayı'nda onunla evlendi. Bu evliliğe karşı çıkan bir grup Kastilya soylusu, tahtın gerçek verisinin Isabel değil Enrique'nin la Beltraneja olarak bilinen kızı Juana olduğunu öne sürdüler. Kral da, Isabel'in kendisinin onayını almadan Fernando'yla evlenmekle tahta itaatsizlik ettiğini, böylece 1468 anlaşmasını çiğnediğini ileri sürerek bu grubu destekledi ve Juana'nın tahta çıkabilmesi için Guienne dükünün desteğinin sağlamaya çalıştı.Isabel ve Enrique daha sonra uzlaşmaya vardılarsa da, uzun yıllardan beri süren taht mücadelesi, kralın ölümünün (1474) hemen ardından bir iç savaşa dönüştü.    

Isabel'i Santa Fe'de ziyaret eden Kristof Kolomb, Avrupalıların Amerika kıtasına yerleşmesiyle sonuçlanacak yolculuğa çıkmak için onun desteğini istedi. Isabel'in bu seferin masraflarını karşılamak amacıyla mücevherlerini verdiği ileri sürüldüyse de, Kolomb'a yalnızca sınırlı bir mali destek sağladığı bilinmektedir. Bu yolculuğun sonunda keşfedilen Yenidünya, daha önceki keşif seferlerinde de olduğu gibi papalığın onayıyla Kastilya tahtına bırakıldı.

Ferdinand ile İzabel'in 1469 yılındaki evliliği İspanya'yı birleştirmiş, bu da bir yerde Müslümanlara karşı zaferi mümkün kılmıştır. Hükümdarlıklarından önce İspanya, başlıca ikisi Aragon ve Kastilya olan bir dizi eyaletten oluşuyordu. Aragonlu Ferdinand Kastilyalı İzabel ile evlenince bu iki eyalet güçlü bir krallık oluşturacak şekilde birleşti. İzabel "ateşli" bir Hıristiyan'dı. 1478 yılında Papa'dan Hıristiyan dünyasındaki sapkınlığı ortadan kaldırmak için bir engizisyon başlatmak için izin istedi. Papa kabul etti ve 1 Kasım 1478'de Exigit Sincere Devotionis adlı bir kararname çıkardı. Arkasından Ferdinand ile İzabel 27 Eylül 1480'de bir kraliyet kararnamesi yayınladı.Kraliyet kararnamesi engizisyonun gizlice Yahudi inançlarına bağlı olan ve Yahudilerin ayin ve törenlerini uygulayarak Hıristiyanlığa karşı gelen, din değiştirmiş Yahudileri aramak ve cezalandırmak için kurulduğunu özellikle belirtiyordu. Başka hiçbir grup ve amaçtan söz edilmiyordu. Bu da engizisyonun oluşturulması ile İspanya'daki Yahudi yaşamı arasındaki yakın ilişkiyi gösteriyordu. Bu ilişkiyi gösteren başka olaylar da vardır.

Isabel'in hükümdarlığı sırasında Andalucia'da Enkizisyon kuruldu (1478) ve Hıristiyanlığı benimsemeyen Yahudiler ülkeden sürüldü. Öte yandan 15. yüzyılın başlarında uygulanmaya konmuş olan kilise reformları bu dönemde hız kazandı. Isabel son derece dindar bir kişi olmasına ve Papa IV. Alexander tarafından Fernando'yla kendisine verilmiş olan onursal Katolik unvanını taşımasına karşın, papalığa karşı kararlı bir politika izledi. Bu doğrultuda papanın İspanya'daki arpalıklara kendisinin onayını almadan atama yapmasına ve Kastilya tahtının kilise üzerindeki geleneksel haklarının çiğnenmesine karşı çıktı. Gene bu siyasetin bir parçası olarak boş Cuenca piskoposluğunabir İtalyan kardinalin getirilmesini reddederek, dört yıl sonra bu göreve bir İspanyolun atanmasını sağladı. Ayrıca, papanın yeğeninin Sevilla piskoposu olmasını önledi.

Isabel'in hükümdarlığının son yıllarında önce tek oğlu ve varisi Juan (1497), ardından da kızı Portekiz kraliçesi Isabel (1498), daha sonra da kendisinden İspanya ile Portekiz'i birleştirmesi beklenen torunu Miguel (1500) öldü. Bunun üzerine sonradan Deli lakabıyla anılan öteki kızı Juana Kastilya tahtının varisi ilan edildi. Isabel'in son yıllarında kazandığı en büyük başarılardan biri askeri amaçla kurulmuş olan Alcantara, Calatrava ve Santiago tarikatlarına ait geniş toprakların krallığa bağlanması oldu.

Isabel'in yaşamına ve hükümdarlık yıllarına ilişkin başlıca kaynak vasiyetnamesidir. İber Yarımadasında siyasi birliğin sağlanması, Cebelitarık üzerinde denetim kurulması, Kuzey Afrika'daki yayılma politikası, Yenidünya yerlilerine karşı izlenen siyaset ve kilise reformları gibi önemli siyasi konulardaki değerlendirmelerinin yer aldığı bu vasiyetname, İspanya tarihine ışık tutan önemli bir belge niteliğindedir.